熒光顯微鏡標本制作特點和觀察要求

　　(1)載玻片：載玻片厚度應在0.8—1.2mm之間，玻片太厚吸收光多，激發光難以在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

　　(2)蓋玻片：蓋玻片厚度應約0.17mm，光潔。為加強激發光，也可用幹涉蓋玻片，這種特制蓋玻片的表面鍍有若幹層對不同波長的光起不同幹涉作用的物質(如氟化鎂)，它可以使熒光順利通過而反射激發光，這種反射的激發光可激發標本中的熒光。

　　(3)標本：組織切片或其他標本不能太厚，一般以5～20pm為宜，切片太厚可使激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察的標本上部不能被激發。切片折疊或雜質過多均可影響熒光的觀察。

　　(4)封片劑：封片劑必須無自發熒光、五色透明。加上抗淬滅劑後再用指甲油(實際操作中體會指甲油封片效果很好，可做到薄而均勻)將蓋玻片四周封固，既保持蓋玻片不滑動，又能防止抗淬滅劑蒸發。在沒有抗淬滅劑的情況下，也可使用含30%甘油的PBS，還可用甘油與0.5mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.0～9.5)等量混合液作封片劑。

　　(5)鏡頭的清潔：在油鏡使用完畢後，需用擦鏡紙沾上無水乙醇或3：7的醇醚混合液輕輕擦拭。

　　(6)及時觀察：標本染色後應及時觀察，因時間過長熒光會逐漸減弱。若標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間。

正置顯微鏡應用的和注意事項

 　　1、安放 右手握住鏡臂，左手托住鏡座，使鏡體保持直立。桌面要清潔、平穩，要選擇臨窗或光線充足的地方。單筒的一般放在左側，距離桌邊3～4厘米處。

　　2、清潔 檢查顯微鏡是否有毛病，是否清潔，鏡身機械部分可用幹淨軟布擦拭。透鏡要用擦鏡紙擦拭，如有膠或粘汙，可用少量二甲苯清潔之。

　　3、對光 鏡筒升至距載物台1～2厘米處，低倍鏡對准通光孔。調節光圈和反光鏡，光線強時用平面鏡，光線弱時用凹面鏡，反光鏡要用雙手轉動。 若使用的為帶有光源的顯微鏡，可省去次步驟，但需要調節光亮度的旋鈕。

　　4、安裝標本 將玻片放在載物台上，注意有蓋玻片的一面一定朝上。用彈簧夾將玻片固定，轉動平台移動器的旋鈕，使要觀察的材料對准通光孔中央。

　　5、調焦 調焦時，先旋轉粗調焦旋鈕慢慢降低鏡筒，並從側面仔細觀察，直到物鏡貼近玻片標本，然後左眼自目鏡觀察，左手旋轉粗調焦旋鈕抬升鏡筒，直到看清標本物像時停止，再用細調焦旋鈕回調清晰。 操作注意：不應在高倍鏡下直接調焦;鏡筒下降時，應從側面觀察鏡筒和標本間的間距;要了解物距的臨界值。 顯微鏡，如觀察者雙眼視度有差異，可靠視度調節圈調節。另外可相對平移以適應操作者兩眼間距。

　　6、觀察 若使用單筒顯微鏡，兩眼自然張開，左眼觀察標本，右眼觀察記錄及繪圖，同時左手調節焦距，使物象清晰並移動標本視野。右手記錄、繪圖。 鏡檢時應將標本按一定方向移動視野，直至整個標本觀察完畢，以便不漏檢，不重複。 光強的調節：一般情況下，染色標本光線宜強，無色或未染色標本光線宜弱;低倍鏡觀察光線宜弱，高倍鏡觀察光線宜強。除調節反光鏡或光源燈以外，虹彩光圈的調節也十分重要。

　　(1)低倍鏡觀察 觀察任何標本時，都必須先使用低倍鏡，因為其視野大，易發現目標和確定要觀察的部位。

　　(2)高倍鏡觀察 從低倍鏡轉至高倍時，只需略微調動細調焦旋鈕，即可使物像清晰。 使用高倍鏡時切勿使用粗調焦旋鈕，否則易壓碎蓋玻片並損傷鏡頭。 轉動物鏡轉換器時，不可用手指直接推轉物鏡，這樣容易使物鏡的光軸發生偏斜，轉換器螺紋受力不均勻而破壞，最後導致轉換器就會報廢。

　　(3)油鏡的觀察 先用低倍鏡及高倍鏡將被檢物體移至視野中央後，再換油鏡觀察。油鏡觀察前，應將顯微鏡亮度調整至最亮，光圈完全打開。 使用油鏡時，先在蓋玻片上滴加一滴香柏油(鏡油)，然後降低鏡筒並從側面仔細觀察，直到油鏡浸入香柏油並貼近玻片標本，然後用目鏡觀察，並用細調焦旋鈕抬升鏡筒，直到看清標本的焦段時停止並調節清晰。 香柏油滴加要適量。油鏡使用完畢後一定要用擦鏡紙沾取二甲苯擦去香柏油，並再用幹的擦鏡紙擦去多餘二甲苯。

　　7、結束操作 觀察完畢，移去樣品，扭轉轉換器，使鏡頭V字型偏於兩旁，反光鏡要豎立，降下鏡筒，擦抹幹淨，並套上鏡套。 若使用的是帶有光源的顯微鏡，需要調節亮度旋鈕將光亮度調至最暗，再關閉電源按鈕，以防止下次開機時瞬間過強電流燒壞光源燈。